Обзор Содержание (предварительно) Содержание книги «Редактрование


с. 1 с. 2 ... с. 5 с. 6

л

УДК-577.123 =====Обзор============

Содержание (предварительно)

Содержание

книги «Редактрование РНК, Гипотетические Механизмы и Контуры Новой Парадигмы».

Часть I. Редактирование РНК и другие внутриклеточные механизмы регуляции экспрессии генов.

Резюме . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.Введение. Множество видов и объектов редактирования у различных организмов ... .
1.2 Редактирование РНК у некоторых вирусов . . . . . . . .
1.3 Минимально-редактируемые участки транскриптов различных генов . . .
2.Некоторые особенности U-вставочно/делеционного редактирования пре-мРНК

у трипаносом . . . . . . . . . . . . .

2.1 Общий экскурс



2.2 gRNA-зависимое редактирование . . . . . . . .
2.3 Миникольцевая и максикольцевая компоненты ДНК кинетопластов трипаносом .
3. Другой тип вставочного (и др. видов) редактированиия РНК у простейших . .
4. CU редактирующее дезаминирование у животных . . . . . . . .


    1. (CU)/(dCdU) редактирующее дезаминирование в иммуноглобулинах у

животных. . . . .
5. АI редактирующее дезаминирование у животных . . . . . . . .
6. Редактирование тРНК у различных видов . . . . . . . . . . .
7. Редактирование РНК в хлоропластах и митохондриях растений . . . . .
Заключение … …. . . . . .

Аббревиатура . . . . . . . .
Abstract . . . . . . . .
Список литературы . . … . ….. . . .

Часть I. Редактирование РНК и другие внутриклеточные механизмы регуляции экспрессии генов.
2005 г., Дейчман А.М., Цой В.Ч., Барышников А.Ю.

Онкологический Научный Центр, 115478 Москва, Каширское шоссе д.24.

tel/fax 7-095-(394.62.39), E.mail: deichman@mtu-net.ru, amdeich@rambler.ru

(Опубликовано: Москва 2005, Изд-во «Практическая Медицина»)
Резюме:
Обзор литературы касается феномена редактирования РНК у разных видов – от простейших и растений до человека. Рассматриваются различные типы редактирования РНК, включая делеции/вставки и замены отдельных нуклеотидов, наблюдающиеся в митохондриях, ядре, хлоропластах. Встречаются как общие для всех трех (CU редактирующее дезаминирование), так и более характерные для отдельных клеточных органелл (U-делеционно/вставочное редактирование в митохондриях трипаносом; АI редактирующее дезаминирование в цитоплазме и ядре для ядерных и вирусных пре-мРНК) типы редактирования РНК. Также встречаются некоторые условно минорные и экзотические виды редактирования РНК. Рассматривается возможная связь феномена редактирования РНК с другими процессами экспрессии генов (транскрипцией, трансляцией, сплайсингом, др.) в индивидуальном развитии организма и филогенезе. Особое внимание уделяется сложной организации редактирующих комплексов (эдитосом), формируемых из различных неферментативных компонент (как мРНК, малых направляющих РНК – митоондриальных gRNAs и ядерно/ядрышковых snRNAs/snoRNAs, дополнительных структурных белковых факторов, ионов Zn+2 и др.), и ферментативных активностей (как РНК-лигазная, эндо- и экзонуклеазная, концевая уридинтрансферазная, дезаминазная, геликазная и др.). Обращается внимание на факт матричной зависимости редактирования РНК от мРНК (как при CU дезаминировании), от двунитевой РНК (как при АI дезаминировании), либо от смешаной gRNA—mRNA гибридной химеры (как при U-делеционно/вставочном редактировании). Связанные с делециями/вставками и заменами отдельных нуклеотидов различные виды редактирования РНК сопровождаются появлением множества эффектов, таких как замена нуклеотидов в кодонах аминокислот, появление/ /исчезновение стоп/старт кодонов, сдвиг рамки считывания, порядок воссоединения фрагментов РНК при сплайсинге, и других. В результате этих эффектов возможно появление ранее скрытого белкового полиморфизма, удлиненных и укороченных форм белков (как для аполипопротеина-Б). Отмечается возможная связь белкового и других видов полиморфизма с редактированием РНК при различных нормальных и патологических (включая онкогенез) процессах.

Ключевые слова: редактирование РНК, митохондрии, ядро, хлоропласты.

Введение
1.Множество видов и объектов редактирования у различных организмов
Редактирование РНК – феномен любого посттранскрипционного (иногда ко-транскрипционного) изменения (кроме РНК-сплайсинга и полиаденилирования) в первичной последовательности РНК, при котором обнаруживают изменения единичных (как правило, специфических) и/или множества (специфических и неспецифических) нуклеотидов соответствующих экспрессируемых генов от одноклеточных простейших до человека. При этом в различных генетических системах функционируют на первый взгляд не связанные друг с другом механизмы, обнаруживающие, однако, и некоторое подобие в своих биохимических стратегиях, регулирующих последовательностях и клеточных факторах, ответственных за такие необычные события РНК-процессинга (Gott, Emeson 2000). Редактируемые последовательности РНК этих генов не коллинеарны своим геномным гомологам.

Редактируемыми генами (криптогенами) называют гены, мРНК которых подвергаются названным изменениям, и обнаруживают такие различия в составе клонируемой кДНК (cDNA) транскрипта того или иного гена. Кроме кодирующих белки пре-мРНК, редактированию могут подвергаться транспортные (Lonergan et al.,1993) и рибосомальные РНК (Mahendran et al.,1994), а также (реже) транскрипты некодирующих областей генома. Феномен редактирования РНК распространен очень широко у многих эукариотических организмов и вирусов, причем у разных видов способы и результаты этого процесса могут сильно отличаться (Юрченко 1999). Не исключено, что в ближайшие годы будут открыты новые способы редактирования, что, в свою очередь, приведет как к интенсификации научных исследований в этой области, так и к определенному пересмотру сущности и роли этого явления для процесса эволюции живых организмов (Benne 1993).

РНК-редактирующий механизм представляется весьма загадочной и, вероятно, одной из древнейших форм процессинга (Sloоf, Benne 1997; Blanc et al.,1996; Heisel et al.,1994; Sper-Whitis et al.,1996), который чаще происходит посттранскрипционно («причудливая» форма транскрипции) в области специфических сайтов, и так называемых сайтов «узнавания» (Konstantinov, Moller 1994). При этом на уровне молекул РНК обычно происходят делеции/вставки, а также конверсионные замены отдельных (иногда пары, нескольких) нуклеотидов (Yoshinaga et al.,1996; Petselt et al.,1997 ; Patton et al,1997; Petshek et al.,1996; O’Connel et al,1997; Юрина, Одинцова, 1998). Редактируются не только кодирующие части генома – мРНК, тРНК большинства митохондриальных, реже ядерных и хлоропластных генов – но также и некоторые интроны, спейсеры, неидентифицированные открытые рамки считывания (ОРС=ORF); причем как в нормальных, так и в некоторых патологически измененных, включая опухолевые, клетках (Melher et al.,1995). Два известных вида гидролитического РНК-дезаминирования (С→U, и А→I) нуклеозидов и нуклеотидов могут быть причиной генетической нестабильности, опосредующей связь между РНК-редактированием и раком (Anant, Davidson 2003). Также редактирование обнаружено в клеточных генетических элементах и вирусных генах (Barciszewska et al.,1994; Herbert 1996; Kubo, Mikami 1996; McGormic-Graham, Romero 1996). С середины 80-х годов изучение редактирования эукариотической РНК интенсифицировалось, и оказалось, что этот процесс – широко распространенный феномен, наиболее часто встречающийся в митохондриях, менее часто в хлоропластах, и только несколько случаев описаны для ядра (Lavrov et al., 2000).

Следует упомянуть некоторые конкретные примеры, где феномен редактирования имеет место. Так в ядерной 5S рРНК эукариот предполагают редактирование (и сплайсинг) первичного транскрипта, в котором обнаруживают множество замен и делеций/вставок единичных нуклеотидов (Szymanski et al.,1995). У высших растений в митоходриях наблюдали редактирование тРНК в акцепторном и антикодоновом стеблях, и в D-петле гистидиновой тРНК лиственницы (Marechal-Dronard et al.,1996b), в пре-мРНК белков системы окислительного фосфорилирования и мРНК рибосомальных белков, а также в интронах пре-мРНК и рРНК (Юрченко 1999) . Также редактирование показано в содержащем матуразу (matK) интроне тРНК лизина ячменя (Vogel et al.,1997), в некоторых мРНК белков участвующих в фотосинтезе, но не обнаруживалось в тРНК и рРНК хлоропластов (Юрина, Одинцова 1998), а также в транскриптах пластид водорослей и генов цианобатерий (Одинцова, Юрина 2003).

Редактирование мРНК -амилоидного белка-предшественника вызывает сдвиг рамки, что, по-видимому, является важным фактором патогенеза широко встречающихся несемейных ранних и поздних форм болезни Альцгеймера (Leeuwen et al.,1998). Нарушение зрения у пациентов с болезнью Oguchi можно было бы связать с мутацией (делецией 1147А) в гене arrestin-белка – важном для выполнения данной функции. Однако оказалось, что мРНК этого широко экспрессируемого (в том числе эктопически: в мышцах, коже, плаценте, клетках крови; и в пяти различных тканях глаза: сетчатке, передней капсуле, радужной оболочке, хрусталике и бульбарной конъюктиве) гена, имела нормальную последовательность, но функция при этом не восстанавливалась. Таким образом роль предполагаемого редактирования здесь остается возможной, но не проясненной (Wada et al., 1999).

Так как обнаружена корреляция между повышением уровня редактирования РНК и частотой реверсии к плазмидо-опосредованной фертильности в клетках высших растений (сорго, табака и риса) при цитоплазматической мужской стерильности (ЦМС), то можно предполагать наличие косвенной связи между этими процессами (Howad,Kempken 1997; Zabaleta et al.,1996; Van Tang et al.,1996; Iwabuchi et al.,1993; Blanc et al.,1996). Отмечали независимые делеционно/вставочное и заменные виды редактирования в транскриптах мтДНК (мт – митохондрии) разных видов (Takano et al.,1997). Интересно отметить, что процесс редактирования не работал при трансгенном введении митохондриальных последовательностей в хлоропласты табака. Возможно, это объясняется неидентичностью этого феномена в различных биологичсеских системах и органеллах (Sutton et al.,1995; Zeltz et al.,1996). Cчитают, что редактирование является существенной частью процесса переноса биологической информации, требующего такой же точности, как и при репликации, транскрипции, трансляции (Jakubowski 1995).

Развиваясь лавинообразно с середины 80-х годов, это направление к настоящему времени насчитывает многие сотни работ. Так данные сети Internet (MedLine) показывают, что в 1986-1987 годах зарегистрировано только по 1-2 статьи, в 1988 году – 7 статей, за период 1989-1993 годов - уже по 20→76 статей/год, и, наконец, за 1994-2003 годы можно обнаружить уже более чем по 1.5-2 сотни статей ежегодно. Редактирование РНК наиболее часто связывают с транскрипционно активными областями ДНК митохондрий, ядра, хлоропластов. Одновременно отмечают взаимную зависимость редактирования и трансляции, т.к. нарушение последней, как минимум, ведет к дефициту по дополнительным белковым факторам, необходимым для редактирования (Karcher,Bock 1998; Hirose et al.,1998; Hirose,Sugiura1997). В свою очередь в сборке рибосом участвуют преимущественно редактируемые белки (Phreaner et al.,1996). Больше половины всех работ, где показано редактирование, касается митохондрий, значительная часть – ядра, а меньшая – хлоропластов.

Не исключено, что ответ на очень интересный, но пока больше обсуждаемый вопрос редактирования РНК у прокариот является только вопросом времени (Brennicke et al., 1999), и может быть получен уже в ближайшие годы. А факт того, что уже известны разные виды редактирования эукариотической РНК митохондрий и хлоропластов, т.е. органелл, вероятно происходящих от прокариото-подобных эндосимбионтов, подчеркивает важность изучения этого вопроса (Brennicke et al.,1999). Так, например, CU конверсии подвергаются имеющие своих прокариотических гомологов единичные мт-мРНК рибосомального белка S2 пшеницы (возможно риса, кукурузы, но не двудольных, где rps2 ген скорее кодируется ядром) – что сопровождается изменениями в кодированиии аминокислот (Vaitilingom et al., 1998). Впервые показано, что, имеющий своего дрожжевого гомолога (по Tad2p субъединице), прокариотический тРНК-редактирующий фермент tadA (тРНК-аденозиндезаминаза из E.coli) способен к сайт-специфическому редактированию качающихся позиций (например поз.№34 в Арг2-тРНК) нуклеотидов. Этот прокариотический фермент мог специфически связывать и модифицировать дрожжевой тРНК(Асп)-минисубстрат главным образом за счет антикодоновой петли, имеющей необходимую для этого вторичную (стебель/петля) структуру (Wolf et al., 2002).



Загадочность процесса редактирования, обычно, связывают с тем, что: – (1) оно требует неочевидных селективных преимуществ по созданию независимо редактируемых, и, вследствии этого, ускоренно эволюционирующих последовательностей, т.е., одновременно, с неясностью в вопросах выбора сайта редактирования, и формирования спускового механизма запускающего целую редактирующую машину (Covella, Gray 1993; Shields,Wolfe 1997; Slobf, Benne 1997; Mundel, Schuster 1996; Lu et al., 1998); кроме того, ничего не понятно в отношении конечных целей (Blanc et al., 1996) редактирования;

– (2) до сих пор в значительной степени не известен механизм этого неодношагового фермент-каскадного процесса (Karcher,Bock 1998; Williams et al.,1998; Adler, Hajduk 1997; Barcizewska et al.,1994);

– (3) наконец, не понятно, почему клетки часто предпочитают постоянно содержать и запускать энергоемкие «редактирующие машины» (для клеточных и вирусных транскриптов), вместо того, чтобы однократно, в частности точечно – или по нескольким сайтам, внести нуклеотидные изменение в сами гены «надолго».

Нетрудно заметить, что редактирование молекул РНК, по-существу, нарушает принцип коллинеарности, в соответствии с которым один ген отвечает за синтез только одной формы белка (Petzelt et al.,1997; Chang et al.,1997), или тРНК, декодирующей только один кодон (Borner et al.,1996). Вероятно, белковый полиморфизм высших растений, в частности рибосомального белка rps12 Petunia, широко распространен. Редактированию по основным и дополнительным сайтам могут подвергаться все, либо часть молекул мРНК этого гена (Lu et al.,1996; Ito et al.,1996; Wilson, Hanson 1996). Связанный с редактированием РНК, белковый полиморфизм, вероятно, проявляется в результате предшествующего ему полиморфизма на уровне молекул РНК – в частности лассо-подобных интронов II группы (Heltzer et al.,1997), обладающих свойствами рибозимов (возможно первичных нуклеозимов). Это частично согласуется с концепцией мира РНК-геномов (Stuart 1993a), тем более, что и современный РНК-Мир (RNA-World) характеризуется метаболическим включением молекул РНК в целое множество ключевых событий: трансляцию (через тРНК и рРНК), контроль качества трансляции (тмРНК=tmRNA; показаны у некоторых водорослей и широко распространены среди бактерий (Одинцова, Юрина 2003)), созревание рибосом (snoRNA), РНК-процессинг (snRNA, snoRNA), репликацию (теломерные РНК), транслокацию белка (SNP RNA), клеточный транспорт (vRNA), u др.; истоки и предпосылки такого разнообразия могли сформироваться еще в эпоху пребиотического РНК-Мира (Meli et al., 2001).

В соответствии с этой концепцией, и применительно к биологическим системам, которые обязательно используют днРНК (двунитевую РНК) в качестве субстрата при редактировании (как это имеет место при АI редактирующем дезаминировании GluR-рецептора мозга животных), опосредованный днРНК филогенез нуждается в необратимой компоненте для протекания РНКРНП...эволюционных превращений. В этом процессе РНК-реликты постепенно замещаются белками, берущими на себя роль биологических катализаторов, конкурирующих за малые молекулы, и запускающих сложный вариант РНК-процессинга. При этом формируются: проторибосомы, различные малые РНК, пре-тРНК, тРНК-процессинг, способность к рекомбинациям, сплайсингу, некоторым видам редактирования и др. Предполагают, что редактирование может играть определенную роль в создании такой необратимой компоненты (Jaffares et al., 1998). В этом смысле важна роль специфических днРНК-связывающих белков (DSRBPs), участвующих, помимо РНК-редактирвания, также в процессах транскрипционной активации, ингибирования инициации трансляции, клеточной локализации мРНК, стабилизации, сигнальной трансдукции, и пост-транскрипционного генного молчания (PTGS). Гены, продукты которых связываются с поли-U/поли-C-субстратом, определяются как потенциально кодирующие такие РНК-связывающие белки (Ramanathan et al., 2003).

К таким белкам (более 20) относят растущее семейство эукариотических, прокариотических и кодируемых вирусом продуктов, эволюционно сохраняющих способность к распознаванию днРНК (что важно как для экспрессии гена, так и поддержания защитных противовирусных механизмов), и совместно использующих общий консервативный мотив, специфически облегчающий взаимодействие с днРНК-участками, а повреждение их у гомо- и даже гетерозигот может вести к эмбриональной летальности (Saunders, Barber 2003). Кроме того, описаны мультифункциональные регуляторные белки челночного РНК-метаболизма, способные взаимодействовать не порознь с ДНК или с РНК, а одновременно контролировать и ядерные и цитоплазматические шаги генной экспрессии (Wilkinson, Shyu 2001). Компьютерный анализ человеческого и мышиного геномов показал, что перекрывающиеся, но противоположно ориентированные транскрипты имеют потенциал к образованию совершенных сенс-антисенс эндогенных днРНК-дуплексов. Такие дуплексы, кроме редактирования РНК, связывают с различными явлениями: геномным импритингом, интерферирующими РНК (iRNA), регулированием трансляции, альтернативным сплайсингом. Биоинформационный подход позволил выявить более 300 новых кандидатов в перекрывающиеся транскрипционные единицы (Shendure, Church 2002).

Процессинг эукариотической РНК, включая альтернативный сплайсинг и редактирование, может генерировать несколько различных сообщений одного гена. Как следствие, пул РНК, определяемый как риботип, варьирует, и имеет различные информационные составляющие, одной из которых является усиленный редактированием риботип. Предполагают, что, если такой риботип востребован в течение длительного срока естественной селекции, то он может быть включен в состав генома. А эукариотическая эволюция, следовательно, определяется альтернативными путями, в которых ДНК и процессирующая РНК постоянно взаимодействуют (Herbert, Rich 1999).

Как и следовало ожидать, к настоящему времени единого общепринятого мнения о роли и месте редактирования РНК, как сверхдополнительного кодирующего механизма, в контексте сопряженности его с другими общебиологическими процессами функционирующего генома, обеспечивающего эволюцию индивидуума и вида, еще не сложилось (Benne 1993; Stuart 1998). Так некоторым авторам представляется, что между большой частотой встречаемости изменений отдельных нуклеотидов на РНК-уровне при редактировании, и возвратными мутациями на ДНК-уровне (Grienenberger 1993), может существовать связь (гипотетически – в результате обратнотранскриптазной активности по отношению к фрагменту РНК. Природа такой связи достаточно запутана, т.к. в этом случае в результате редактирования РНК кроме вероятного белкового полиморфизма, связанного с экспрессией редактируемых и нередактируемых форм РНК (Lu et al., 1996), должен выявляться и механизм, связанный с генетическим полиморфизмом. Данных прямо подтверждающих это нет, а распространенность редактирования в клеточных органеллах связывают с механизмом противостояния накоплению мутаций в асексуальных генетических системах (Borner et al., 1997).

Тем не менее, при изучении генов цитохромоксидазы (субъединиц cox-II,III) высших растений приходят к выводу о возможной близости направлений нуклеотидных изменении в РНК (при редактировании) и ДНК (за время филогенетической реконструкции). Выделяют потенциальную роль UC редактирования в генерации точечных нуклеотидных замен в кДНК-транскриптах бомбезин-подобных нейропептидов у амфибий и животных (Nagalla et al.,1994). Одновременно отмечают, что гены некоторых белков (в частности кинетопластных СОIII генов семи видов трипаносом), транскрипты которых подвергаются широкому редактированию, накапливают мутации ~ в 2 раза быстрее, чем нередактируемые и ограниченно редактируемые версии (Landweber, Gilbert 1993).

В то же время другие авторы не рассматривают в качестве вероятной такую связь между редактированием РНК и филогенетической реконструкцией ДНК, обратными мутациями и точечными заменами в ДНК. Они считают, что обусловленный редактированием скрытый белковый полиморфизм не имеет отношения к эволюции генома (за исключением ТC транзиций в кодирующей части ДНК), а редактирование, в целом, является лишь внутренним для транскрипции процессом. И даже предполагают некорректный филогенез в том случае, если редактируемые последовательности будут переноситься между ДНК-содержащими клеточными структурами (Bowe, Pamphilis1996) – тем более, что пока напрямую такой перенос для редактируемых последовательностей не показан. Естественно, что до тех пор, пока объективно не будет показано существование или отсутствие такой связи (впрочем, как и раздельное существование обоих этих вариантов), и скептицизм, и оптимизм по поводу существования ее будут одинакого оправданы. Однако в любом случае, все компоненты и активности, связанные с редактированием, кодируются геномом, и, следовательно, укладываются в рамки Central Dogma молекулярной биологиии «ДНК делает РНК делает Белок». В то же время природа появления некоторых компонент редактирования, например, способности к самовозобновлению gRNAs («гид»-РНК) в макси- и миникольцевой компонентах кинетопластной ДНК митохондрий трипаносом (см. следующий раздел), все еще остается не ясной и оставляет место для различных предположений (Benne 1993) и существования неизвестных механизмов и структур (Дейчман, Цой, Барышников 2005).

В результате редактирования могут: (1) появляться и исчезать укороченные и удлиненные формы белковых молекул при регуляции терминирующим кодоном (Davidson et al.,1995; Heinemann et al.,1994); (2) создаваться инициаторные, включая 4-х нуклеотидные (Yoshinaga et al.,1997; Thomson et al.,1994) кодоны, которые бывают предпочтительнее обычных (Hirose, Sugiura 1997; Sugiura 1995; Yoshinaga et al.,1996; Wakasugi et al.,1996). Однако пиримидиновые и большая часть пуриновых (кроме 3-х терминирующих кодонов) транзиций по 3-му нуклеотиду принципиально не могут вести к новому фенотипическому проявлению кодона (Phreaner et al.,1996); (3) соседние аминокислоты белка могут принадлежать далеко отстоящим триплетам кодонов, вначале разобщенных интроном, но соединяемых затем сплайсингом. Направленность редактирования в разных генетических системах может не совпадать: так в митохондриях трипаносом строгая 3’→5’ направленность соблюдается, по крайней мере, в отношении конкретно редактируемого сайта, а в митохондриях миксомицета Physarum polycephalum и в органеллах у высших растений предпочтения в направленности редактирования не показано (Benne 1993).

Выбор сайтов для редактирования может зависеть от первичной структуры РНК (Kubo, Mikami 1996; Williams et al., 1998), но некоторые кодируемые ядром ферменты, в частности, зависимая от днРНК аденозиндезаминаза животных, не имеют явной специфичности к днРНК (Kim et al.,1994). Общей первичной структуры при редактировании РНК в различных генетических системах не обнаружено (Benne 1993). В целом механизмы редактирования связывают с:

матрично-направляемыми процессами с участием специальных малых направляющих митохондриальных (gRNAs) и ядерно/ядрышковых (snRNA/ snoRNA) РНК, состав которых прямо (как в случае митохондриальных gRNAs), или косвенно (как в случае малых ядрышковых РНК, snoRNA, направляющих метилирование в рРНК) влияет на нуклеотидное редактирование в РНК трипаносом (Stuart 1993b; Levitan et al.,1998);

необычными ферментативными процессами, ведущими, в частности, к транзициям (Blanc et al.,1996), и зависящими от РНК, либо от днРНК – соответственно при CU и АI дезаминировании у животных (Anant 1997; Bass 1997). Однако роль матрицы вероятна и здесь.

О том, как сочетаются различные виды редактирования в одной и той же клетке, органелле (как это наблюдали в митохондриях P. polycephalum) в настоящее время судить трудно, т.к., естественно, каждый вид редактирования изучается пока индивидуально. Тем не менее некоторым авторам роль и природа появления редактирующей матрицы представляется более загадочной, чем роль дезаминаз (Blanc et al., 1996). Заметим, что ферментативные виды дезаминирования, очевидно, делятся на матрично-опосредованные (и зависимые от РНК, либо днРНК), и обычные (без редактирования), зависящие от резких сдвигов в предпочтительном увеличении концентрации отдельных нуклеотидов и нуклеозидов в результате биохимических реакций (Blanc et al.,1995; Frech et al., 1996). Эволюционная связь и превращение одних в другие – обсуждаются.

РНК-редактирующий комплекс трипаносом включает различные компоненты (как мРНК, «гид»-РНК, дополнительные белковые факторы комплементации и др.), и активности (такие как РНК-лигазная, концевая уридинтрансферазная, эндо- и экзонуклеазные, геликазная и др.), которые, как правило (Missel,Goringer 1994), обнаруживали в двух различных РНП-комплексах клеточных экстрактов (Adler, Haiduk 1997; Corell et al., 1996). Cложность идентификации различных процессов и объектов редактирования состоит, во-первых, в том, что до сих пор определено мало аминокислотных последовательностей белков, полученных в результате редактирования; показаны (и сравнены с соответствующими редактируемыми мРНК) два из них – субъединица-9 АТФазы трипаносом и аполиполипротеин-Б животных. Недавно для отредактированного в 5’-области мРНК-транскрипта апоцитохрома-b кинетопластов трипаноносом также показана действительно совпадающая с ним по первичной последовательности и функционально активная версия белка (Horvath et al., 2000). Также мало показано и объектов с реально включенными в редактируемую РНК измененными нуклеотидами. Среди таких нуклеотидов, если специально не определять, могут оказаться не обычные (канонические А,G,U,C), а модифицированные, но ведущие себя как канонические нуклеотиды. Во-вторых, главным препятствием быстрого продвижения и проверки множества идей остается невозможность легкого использования систем in vitro для большинства генетических систем. В то же время дополнительных амплифицированных версий редактируемых генов не обнаружено (Benne 1993).



РНК-редактирование – динамично развивающаяся область исследо-ваний, и, конечно, много новых данных появится в ближайшие годы, хотя уже можно проследить некоторые тенденции. При этом необходимо учитывать, что в настоящее время частота встречаемости того или иного вида редактирования в значительной степени зависит от частоты исследования отдельных объектов, а не только от степени распространенности в природе данного вида редактировния по сравнению с другими. В этом смысле среди изменений нуклеотидов CU конверсия – наиболее частый, но действительно общий для всех трех органелл (митохондрий, ядра, хлоропластов) вид редактирования у самых различных видов эукариот (от Physarum polycephalum – до высших растений и животных). Этот тип редактирования, ведущий к появлению смысловых и терминирующих кодонов, обычно связывают с активностью РНК-зависимой цитидиндезаминазы (Thomson et al.,1994). Второй по частоте встречаемости вид нуклеотидных изменений – это U-делеция(реже)/U-вставка(чаще), характерный для митохондрий трипаносоматид (Piller et al., 1997). Третьим из наиболее встречаемых видов изменений нуклеотидов является АI конверсия в результате действия кодируемых ядром и зависимых от днРНК аденозиндезаминаз, редактирующих клеточную и вирусную мРНК (Kim et al., 1994).

Cреди условно минорных видов нуклеотидных изменений наблюдают АG замену в ядре дрозофилы (чаще) и митохондриях земляной улитки (Petschek et al.,1996; Vokobori, Paabo 1995), и UC замену в митохондриях и хлоропластах растений (чаще) и ядре клеток животных (Yoshinaga et al.,1996; Yoshinaga et al.,1997; Beier et al.,1992; Nagalla et al.,1994). В отношении АG замен под действием dADAR – дезаминазы дрозофилы (Ma et al., 2002): в результате редактирования вместо геномного аденина (А) в кДНК-транскрипте белковой субъединицы пре-синаптического канала дрозофилы обнаружен гуанин (G). Эту субъединицу, называемую также Dmca1a полипептидом, кодирует так называемый ген кокафонии (cocaphony=nightblind A), названный так из-за участия в высвобождении нейротрансмитеров, и обнаружения связи между поведенческими вариантами (нейрофункциональными фенотипами) дрозофил и степенью редактирования трех различных сайтов гетерогенных Dmca1a-транскриптов этого гена (Smith et al.,1998; Kawasaki et al., 2002). DHPLC-анализ (денатурирующая высоко-разрешающая жидкостная хроматография) событий микропроцессинга мышиного гомолога этого гена позволил обнаружить сохранение позиций сайтов пост-транскрипционных процессов редактирования единичных нуклеотидов всего в 3% транскриптов, и альтернативного 3’-концевого сплайсинга (Gallo et al., 2002).

Интересно, что и (АG)-сверхредактирование РНК, и экспрессия мРНК эукариотического 4f-rnp-гена плодоносящих дрозофил зависели от регулирующего взаимодействия с антисенс-транскриптом и последующего образования днРНК-стркутур. Оба близко-расположенных (на противоположных ДНК-нитях) гена связанны с Х-хромосомой. Предполагают, что смысл такой регуляции – в прицельной пост-транскрипционной деградации днРНК-мишеней по iRNA-механизму, и ограничении уровня экспрессии мРНК соответствующим антисенс-фактором (Peters et al., 2003), а многообразие форм пре-мРНК dADAR-фермента, определяли многие биологические/физиологические процессы, а также нейрональные функции в ЦНС насекомого (Ma et al., 2002). Также у дрозофил идентифицированы потенциально новые случаи редактирования РНК (Stapleton et al., 2002).

Впервые показано UC редактирование (механизм неясен: транс-аминирование/-гликозилирование, либо замена) в химерной 16S мт-РНК тестикул, спермы и соматических тканей мыши, содержащей дополнительный 121-нуклеотидный 5’-концевой фрагмент, происходящий из L-нити мт-генома. Целая химерная РНК не кодировалась ни митохондриальной, ни ядерной ДНК, а являлась, возможно, результатом транс-сплайсинга и пост-транскрипционных событий. Позиция-121 редактировалась после синтеза химерной 16S РНК (вероятно вне митохондрий), и это не было артефактом клонирования, секвенирования или полиморфизма данного гена. Интересно, что первые 120 нуклеотидов, образуя инвертированные повторы, были полностью комплементарны внутренней (поз.240-360) последовательности 16S РНК, что может предполагать участие больших днРНК-структур в механизме редактирования, подобного тому, что катализируется ADAR(1/2)-ферментами. Функция 16S РНК может быть связана с формированием клеточного полюса, а модификация этого транскрипта – необходимым после оплодотворения шагом. Ранее UC замены описаны для транскриптов растений и WT1-гена опухолей Вильямса крыс и человека (Villegas et al., 2002).

WT1 – супрессорный ген опухоли Вильямса (нефробластомa; частота мутаций – 1 на 10 тыс. новорожденных), рост которой сопровождается генитальными аномалиями, отсутствием радужки, задержкой умственного развития, и др. Это ген в 50 kb, все 10 экзонов которого генерируют мРНК всего в 3 kb (Mrowka, Schedl 2000). Нормальное развитие почек – это высокосложный процесс, требующий точного сочетания пролиферации, дифференцировки и апоптоза клеток органа животного, и зависящий от множества генов, играющих жизненно важную роль во время эмбриональных (про-, мезо-, мета-нефрос) превращений. Мутации в WT1-гене, критическом для нормального развития органа, вели к развитию опухоли и ненормальному развитию почек (DDS- u Fraiser- синдромам). Более 20% WT-опухолей включали делеции, урезания, транслокации, и миссенс-мутации WT1-гена. DDS – редкий конгенитальный детский синдром, включающий диффузный мезангиальный склероз, тяжелую гипертензию, стероид-устойчивый нефросиндром, мужской псевдогерматофроидитизм и высокий риск развития опухоли Вильямса. Из более чем 60 описанных мутаций (фамильных и de novo), ведущих к утрате интактности WT1-белка, большинство были доминант-негативными миссенс-мутациями внутри экзонов 8 и 9, кодирующих, соответственно, 2 и 3 «zinc-finger»-домены, а горячей мутационной точкой была R394W-мутация (нуклеотид 1180). Fraiser-синдром, как впрочем и DDS, зависел от интронных мутаций, ведущих к затруднению узнавания сайта-2 и потере (KTS “+”)-изоформы (см. ниже) белка.

Множество продуктов WT1-гена (известно до 24 изоформ; их соотношения в эмбриогенезе, и за эволюционный период, строго консервативны) обладают транскрипционной и пост-транскрипционной активностями, и определяются: (1) альтернативными трансляционными старт-сайтами (один из них добавляет 68 N-концевых аминокислот), (2) альтернативным РНК-сплайсингом, (3) а также UC РНК-редактированием (Leu280Pro-диморфизм формировался в результате U839С нуклеотидного изменения в экзоне-6). Замеченный только у животных экзон-5 кодирует 17 аминокислот, и эта форма продукта гена повышает промоторную репрессию; а экзон-9 кодировал только три – лизин/треонин/серин(=KTS) – аминокислоты, расположенных между С-концевыми 3-м и 4-м «zinc-finger»-мотивами белка.

Продукт WT1-гена может связаться с промоторными областями более чем 20-ти ниже-расположенных генов (включая рецептор к эпидермальному фактору роста, фактора транскрипции PAX2, и ростовому инсулин-подобному фактору-2), и оказать двунаправленное, в отношении транскрипции, действие – в зависимости от типа клетки и гена-мишени. В частности репрессирующее in vivo/vitro действие продукта WT1-гена (дикого и мутантного типов) отмечено в отношении промотора гена рецептора инсулин-подобного фактора-1 (при экспрессии IGF-1, трансмембранной тирозинкиназы), способного вызывать туморогенный эффект у большого числа опухолевых моделей, а также активировать гиперплазию простаты и рака молочной железы. Причем критической оказалась ДНК-, и, в меньшей степени, белок-связывающая способность продукта (Tajinda et al., 1999; Sharma et al., 1994). WT1 – одновременно транскрипционный и фактор модуляции пост-транскрипционного уровня РНК. Этот белок способен к взаимодействию с РНКнеспецифическому N-концевому узнаванию, и специфическому связыванию через С-концевые «zinc-finger»-мотивы. Кроме того, высокую афинность к РНК обнаружила (KTS“+“)-форма, а к ДНК – (KTS“–“)-форма продукта, которая, подобно транскрипционным регуляторам, диффузно распределена в ядре (Mrowka, Schedl 2000).

Среди условно экзотических видов редактирования, отмечены: в ядре животных – G-вставка (Petzelt et al.,1997), UА замена (Novo et al.,1995), а в митохондриях различных видов (слизистой плесени, земляной улитки, кальмара, низших грибов) – UU-вставка, а также UА, GGАА и А,GU,C и C,U,GА изменения (Gott et al., 1993; Vokobori, Paabo 1995; Tomita et al., 1996; Laforest et al., 1997). Cреди новых типов редактирования также отмечены GА изменения в мРНК фосфотрансферазы (GlcNac-1), UА – в мРНК галактозидазы человека (Villegas et al., 2002), и 14 варьирующих по степени редактирования АG сайтов (транзиций в первом нуклеотиде кодонов, в основном в Т1-домене) в мРНК классического белка, отсрочивающего выпрямление К+-каналов при потенциал-регулируемой реполяризации аксона гигантского кальмара (Rosenthal, Bezanilla 2002). Косвенно с редактированием связывают малые (snoRNA) ядрышковые РНК животных, направляющие метилирование нуклеотидов в рРНК (Levitan et al., 1998; Brule et al., 1998).
1.2 Редактирование РНК у некоторых вирусов
Для вирусов, геномы которых сформированы одно- и двунитевыми последовательностями, замечены А→G и UC изменения нуклеотидов: в ряде случаев эти транзиции, в том числе кластеризованные, могут быть вторичными по отношению к А→I редактирующему дезаминированию под действием кодируемой ядром аденозиндезаминазы. Также замечены А- и G-вставки. Изменения нуклеотидов типа C→U конверсии и U-вставка/делеция здесь не отмечались (Volchkov et al., 1995; Lai 1995). Для РНК-вирусов характерны как точечные, так и гипермутации (т.е. мутаций по множеству сайтов) под действием клеточных ферментов, модифицирующих РНК собственного и вирусного синхронно эволюционирующих геномов. Редактирование вирусных РНК, обладающих свойствами рибозимов, ведет к появлению гипермутаций, сопровождаемых транзициями и множественными аминокислотными заменами (Lai 1995; Сattaneo 1994; Vanchiere et al., 1995; Sanchez et al., 1996).

……………………………………………..

……………………………………………….

1.3 Минимально редактируемые участки транскриптов генов различных видов организмов
Интересно, что в мРНК всех трех органелл - митохондрий, ядра, хлоропластов - далеко отстоящих видов (от простейших – до высших растений и животных) обнаруживают фрагменты (так называемые минимальные кассеты) длиной в 14-29 нуклеотидов, длины которых достаточно для редактирования внутри различных РНК (в том числе гетерологичных, и у альтернативных сайтов собственной РНК) в системах in vitro. Редактируются всегда только новосинтезирующиеся РНК, по очень небольшим, предназначенным для вставок участкам (Lowe et al., 1997; Visomirski-Robic et al., 1997). Внутри таких кассет CU редактирование отмечено для транскриптов ядерного (мРНК Апо-Б) и хлоропластного (psbL) генов (Backus, Smith 1992; Davies et al., 1989; Backus, Smith 1994; Backus et al., 1994; Anant et al., 1995a; Chaudhuri et al., 1996), и U(реже)- и C(чаще)-вставочные виды редактирования для транскриптов митохондриaльных генов у Physarum (Visomirski-Robic, Gott 1997) .

Более часто редактирование CU сайтов шло внутри АТ(AU)-богатых областей (Backus, Smith 1994; Anant et. al., 1995b). При этом небольшой фрагмент в 22 нуклеотида мРНК аполипопротеина-Б проявлял сродство к белкам 66 и 44 кДа редактирующего комплекса (эдитосомы), а наличие так называемых якорной и скрытой якорной последовательностей (необходимых для взаимодействия с редактирующим ферментом), облегчало возвращение к редактированию по основному сайту (Backus et al., 1994). Редактирование внутри минимальных кассет генов psbL (полипептида-L фотосистемы-2) и субъединицы ndhD (НАДН-дегидрогеназы) хлоропластов табака вело к созданию инициирующего (АCGАUG) кодона. ÀC мутация выше сайта отменяла, а GC уменьшала редактирование минимальной кассеты (Chaudhuri, Maliga 1996). В случае АI(G) мутаций по Amber/W-сайту в основной нити РНК-вируса гепатита-D (HDV) с участием аденозиндезаминаз человека (в специальных системах с встроенными reporter-фрагментами), показаны минимально-необходимые субстраты в 24 (для hADAR1; выше сайта требовались 4 пары спаренных оснований) u 66 (для hADAR2; требовалась 21 пара спаренных оснований) нуклеотидов.



Размер минимальных субстратов (и способ узнавания их) для обеих дезаминаз, однако, варьировал у каждого редактирующего сайта (Sato et al., 2001). Величина минимально АI редактируемого субстрата, содержащего одну некомплементарную А:С пару, была еще меньше15 пар оснований – при редактировании белком, включающим только каталитический домен ADAR1-фермента (минимально редактирующая система). Включение Z-ДНК-связывающего мотива усиливало редактирование – вероятно за счет большей субстратной специфичности. В минимальном субстрате в 23 нуклеотида дополнительные два сайта редактирования у 5’-конца (позиции 4-8 пар спирали) наблюдали на комплементарной нити, на расстоянии в 11-15 нуклеотидов от первого сайта (Herbert, Rich 2001). Также интересно, что, в случае U-вставочно/делеционного редактирования пре-мРНК у трипаносом, связанного с использованием gRNAs, протяженность собственно срединно-информационной пурин-обогащенной (в основном аденинами) части gRNA составляeт величину того же порядка (~ 1.5 - 3 десятка нуклеотидов), что и в минимальных кассетах (Simpson et al., 1993).

2. Некоторые особенности U-вставочно/делеционного редактирования пре-мРНК у трипаносом.
2.1 Общий экскурс
С тех пор, как впервые было описано U-вставочно/делеционное редактирование по отдельным и множеству сайтов в пре-мРНК митохондрий (кинетопластах) трипаносоматид, фундаментальный интерес к исследованиям в данной области, касающейся механизма обеспечения сложной системы реализации генетической информации у простейших, не переставал увеличиваться. Самые первые наблюдения касались, во-первых, четырех уридиновых вставок у трех сайтов в митохондриальном транскрипте cox2 гена трипаносомы T.brucei, и, во-вторых, особенностей максикольцевых митохондриалных геномов L.tarentolae, T.brucei и C.fasciculata. В этих максигеномах отсутствовали собственные гены тРНК, но в органеллу из цитоплазмы импортировались кодируемые ядром тРНК. Также отсутствовали инициаторные кодоны многих структурных генов, а регионы, кодирующие некоторые гены, содержали одинакого локализованные сдвиги рамок считывания (Benne et al.,1986; Shaw et al., 1988; Simpson etal.,1989; Kapushos et al., 2000). Вскоре были описаны единичные 5’- и 3’-, а также широкое 3’-5’ виды вставочно/делеционного редактирования мРНК. До сих пор, однако, мало известно о биохимических свойствах и роли белков, включенных в редактирование (Estevez , Simpson 1999).

Современные Trypanosomatidae – одноклеточные жгутиковые, зоофлагелляты, прямые потомки предковых форм, давших начало всем эукариотическим царствам, и, возможно первые клеточные линии с митохондриями. Биогенез митохондрий трипаносоматид уникален еще и тем, что только около 5% белков (касается внутренних мембран органеллы) кодируются мт-геномом, а остальные 95% – это кодируемые ядром белки, импортируемые посттрансляционно. Многие гены содержат неполные открытые рамки считывания (ОРС=ORFs), первичные транскрипты которых ремоделируются РНК-редактированием; в Crithidia fasciculata белковый синтез опосредован типичными мт-рибосомами (Tittawella et.al., 2003) и цитозольными тРНК эукариотического типа, а мт-рибосомы (по рРНК) – мельчайшие из известных (на 30% меньше редуцированных мт-рРНК человека). Наконец с необычным жизненным циклом организма связаны множество различных митохондриальных активностей паразита (Schneider et аl., 2001).

Трипаносоматиды в основном паразитируют у одного (это справедливо в отношении Crithidia, Leptomonas, Blastocritidia и Herpetomonas) или двух хозяев (Leichmania, Trypanosoma, Phytomonas), и инфицируют широкий круг растений, беспозвоночных и позвоночных животных. Паразитизм во втором случае связан со сложным жизненным циклом, и сопровождается восстановлением или подавлением функций дыхательной цепи – в зависимости от условий обитания в данной фазе жизненного цикла. Кроме того, интерес изучения данного объекта состоял еще и в том, что в гомологичных генах разных организмов данной группы (трипаносоматид), отличающихся теми или иными особенностями своей эволюционной истории, протяженность участков, подвергаемых редактированию в пре-мРНК, оказалась различной. К наиболее ярким примерам можно отнести гены 3-ей субъединицы (Landweber et al., 1993) цитохромоксидазы (СОIII), более 90% аминокислотной последовательности которой создается в результате редактирования, 6-ой субъединицы АТФазы (АТРаsе-6) и 8-ой субъединицы (ND8) NADH-зависимой убихиноноксидоредуктазы .

С другой стороны, и вследствие высокой гомологичности первичной структуры некоторых достаточно консервативных и подвергаемых редактированию генов трипаносоматид, можно было предположить, что размер и структура редактируемых участков здесь будут практически одинаковыми. Предполагалось также, что и общее число подвергаемых на уровне пре-мРНК уридиловому редактированию участков, по крайней мере, внутри рода, будет достаточно близким даже для некоторых представителей разных видов (в частности, включая паразитирующие между насекомыми и позвоночными L.tarentolae). Это было показано для большей части исследуемых близкородственных видов рода лейшманий (Колесников и др., 1999), образующих во всех филогенетических построениях наиболее компактную среди других трипаносоматид группу (Юрченко 1999).

Разные виды трипаносоматид могут отличаться интенсивностью редактирования гомологичных генов. В целом эволюционно более рано дивергировавшие трипаносоматиды обладают наиболее мощным и интенсивным редактированием – что, вероятно, свидетельствует о широкой распространенности его в митохондриях предка этой группы (Maslov et al., 1994). Своим хозяевам трипаносомы передаются механическим контактом, половым путем, и через насекомого-переносчика. Африканская Trypanosoma gambiense, переносимая мухой це-це, может вызывать у людей сонную болезнь. Драматическим изменениям в жизненном цикле T. brucei подвергаются митохондриальные (кинетопластные) компоненты дыхательной системы. Попадая в кровяное русло животных вместе с выделяемым при укусе насекомым секретом, трипаносомы обычно теряют цитохромы, компоненты цикла Кребса, и генерируют энергию за счет гликолиза. Наоборот, возвращаясь вместе с кровью животного, и, превращаясь в тонком кишечнике насекомого в проциклические формы, трипаносомы почти полностью восстанавливают способность к синтезу всех компонент окислительного фосфорилирования. Наконец в слюнных железах насекомого образуются инфекционные метациклические формы, которые и передаются животному хозяину. Селективные преимущества роста в той или иной стадии клеточного цикла паразитов как раз и могут, в ряду других механизмов, обеспечиваться редактированием (Stuart 1993а).


2.2 “Гид”-РНК-(gRNA)-зависимое редактирование
Различают «гид»-РНК-зависимое (Simpson 1997) и «гид»-РНК-независимое, но зависимое от вторичной структуры РНК виды редактирования (Frech 1996; Alfonzo 1997).

Молекула направляющей gRNA состоит из 3-х частей (рис.1; (все рисунки в конце)):

– (1) 5’-якорной, необходимой для специфического спаривания и образования первичного якорного дуплекса с 3’-концом пре-мРНК при инициации редактирования (при отсутствии таковой резко падает или полностью прекращается редактирование). Комплементарность за счет стандартных комплементарных пар этой части gRNA в так называемой «гид»-РНК—мРНК (gRNA-mRNA) гибридной химере уже изначально составляет более 90%;

– (2) богатой пуринами (в основном аденином) собственно срединно-информационной части, которая определяет по преимуществу встраивание (реже делецию) уридина в пре-мРНК на следующем этапе редактирования. Этот этап продолжается до тех пор, пока не будет достигнута необходимая степень итоговой комплементарности в расширяющемся дуплексе. После редактироваиня комплементарность увеличивается в 1.5-2 раза и достигает ~70% (Kable et al.,1997);



  • (3) и концевой 3’-олиго-U части, предположительно являющейся одним из источников (реже депозитарием) уридинов, на что указывает обнаруженная ковалентная связь между олиго-U концом gRNA и пре-мРНК у сайта редактирования в субъединице-6 АТФазы трипаносоматид (Rusche et al., 1995). Кроме того 3’-концевая часть обеспечивает дополнительное, но необходимое для редактирования по основному и дополнительным сайтам конформационно-стабилизирующее взаимодействие с пурин-обогащенной частью пре-мРНК. Итоговая комплементарность здесь, 35-40%, слабо отличалась от исходной (Kable et al.,1997).

Рис.1

В соответствии с gRNA-парадигмой кинетопластное U-делеционно/ /вставочное редактирование требует высокой точности, ведет к восстановлению или сдвигу рамки считывания в мРНК, и обусловлено взаимодействием коротких (40-70 нуклеотидов) и обладающих общими структурными свойствами молекул gRNAs с частично комплементарными фрагментами к пре-мРНК. Заметим, что для точно направленного надрезания природа использует транс-активирующие малые РНК в большом числе видов событий (например, для систем РНКаза Р–тРНК; U7–мРНК гистона; snoRNA–рРНК; U5–интрон 1 группы и др.) клеточного РНК-процессинга (Cruz-Reyes et al., 2001). Селекция сайтов с помощью gRNA не является уникальной, т.к. комплементарное (но не меж-, а внутримолекулярное) взаимодействие участков мРНК встречается и при других видах редактирования: у позвоночных и беспозвоночных при А→I дезаминировании, при редактировании тРНК, и при направляемом по 2’-О-рибозе метилировании в рРНК (Sloof, Benne 1997).



с. 1 с. 2 ... с. 5 с. 6

скачать файл